空氣負(fù)氧離子抑制肝癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

—關(guān)于森肽基生態(tài)級(jí)負(fù)氧離子生成機(jī)的實(shí)驗(yàn)研究

陶名章^1*，李慧²，陳少周³，李海濤⁴

（1．中國(guó)空氣負(fù)離子暨臭氧研究學(xué)會(huì)，廣州510300；2. 南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院呼吸睡眠中心，廣州510516;3.香港瑪麗醫(yī)院精神科，香港999077；4.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣州510080）

【摘要】目的 研究空氣負(fù)氧離子對(duì)肝癌hepa1-6細(xì)胞生物活性的影響。方法 把細(xì)胞隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組，空氣對(duì)照組和負(fù)氧離子治療組。治療組根據(jù)負(fù)氧離子作用時(shí)間分為1h組、2h組和4h組。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行tunel染色檢測(cè)凋亡情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化情況，以westernblot法檢測(cè)磷酸化p38mapk的表達(dá)變化。結(jié)果 與空白對(duì)照組和空氣對(duì)照組比較, 空氣負(fù)氧離子治療組肝癌細(xì)胞凋亡率明顯增加,處于s期肝癌細(xì)胞所占有的比例下降明顯, 磷酸化p38mapk 表達(dá)上升明顯, 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p < 0.05)。結(jié)論 空氣負(fù)氧離子通過(guò)阻滯細(xì)胞周期使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡, 進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞，該效應(yīng)是通過(guò)p38mapk信號(hào)通路傳導(dǎo)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

【關(guān)鍵詞】空氣負(fù)氧離子，空氣負(fù)離子，肝癌，p38mapk

study of negative oxygen ions inhibiting liver cancer cells in vitro

tao ming-zhang¹，li hui²,chen shao-zhou³,li hai-tao⁴

(1.china on negative air ions and ozone reseach society，guangzhou 510300，china；2. center of respiration and sleep，nanfang hospital affiliated nanfang medical college，guangzhou 510516，china；3. department of psychiatry，hongkong queen mary hospital，hongkong 999077，china；4. department of neurology，first hospital affiliated sun yat-sen university，guangzhou 510080，china )

【abstract】objective：to investigate the affect on the biologic activity of hepatoma hepa1-6 cell line of negative oxygen ions in vitro. methods dividing the cell into three groups: negative control group, air control

group and treatment group，randomly.dividing the treatment group into 1h、2h and 4h group according to action time of negative oxygen ions, all the cells in each group were detected apoptosis and cell cycle with flow cytometry method, the phospho- p38mapk expression was detected.

by westernblot assay. results：the apoptosis rate increased, the proportion of s stage cell decreased and the expression of phospho- p38mapk increase obviously vs negative and air control group, the difference show significance ( p < 0.05).

conclusion：the negative oxygen ions can induce hepatoma hepa1-6 cell apoptosis through arresting the cell cycle, such effect was mediated by p38mapk pathway.

key words: negative oxygen ions; negative air ions; hepatoma; p38mapk

被譽(yù)為空氣維生素的空氣負(fù)氧離子對(duì)人體健康十分有益。研究表明，它能有效調(diào)整大腦皮層的功能，有鎮(zhèn)靜、催眠及降血壓作用；它能使支氣管平滑肌松弛，解除其痙攣，有效緩解哮喘；它還可以降低血脂水平，提高機(jī)體免疫力及抗腫瘤作用等^[1-4]。目前大多數(shù)研究集中于流行病學(xué)方面的研究，而對(duì)于抗腫瘤和及其作用機(jī)理的研究很少。本實(shí)驗(yàn)就空氣負(fù)氧離子對(duì)體外肝癌細(xì)胞的影響進(jìn)行了系列研究。

1. 材料與方法

1.1 材料

肝癌細(xì)胞株hepa1-6（上海艾研生物科技有限公司）；碘化丙啶（美國(guó)sigma 公司）；tunel細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（德國(guó)boehringer mannheim公司）；鼠抗人單克隆抗體p38mapk和p38mapk 特異性抑制劑sb203580（美國(guó)on-cogene公司），sb203580 使用終濃度為50μmol/l；森肽基生態(tài)級(jí)負(fù)氧離子生成機(jī)（濟(jì)南新活電器公司）；model ic-2000型空氣負(fù)離子檢測(cè)器（瑞典，空氣負(fù)離子檢測(cè)裝置）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

把處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞hepa1-6隨機(jī)分成3組, 即空白對(duì)照組、空氣對(duì)照組及負(fù)氧離子治療組。治療組根據(jù)空氣負(fù)離子作用時(shí)間分成1h組、2h組和4h組。對(duì)照組處理：孵箱中給予普通空氣；空氣負(fù)氧離子組：將孵箱改造成相對(duì)密閉的空間,通過(guò)自制的裝置輸入由森肽基生態(tài)級(jí)負(fù)氧離子生成機(jī)產(chǎn)生的空氣負(fù)氧離子,同時(shí)應(yīng)用空氣離子檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)空氣負(fù)離子濃度, 在實(shí)驗(yàn)前保證空氣負(fù)氧離子濃度不高于500 /cm3,電離后維持空氣負(fù)氧離子濃度在( 2- 3)×106 /cm3。

1.2.2 tunel染色

胰蛋白酶消化5-10代肝癌細(xì)胞, 制成密度為10⁵/ml左右的細(xì)胞懸液。加細(xì)胞懸液于蓋玻片上, 4h后細(xì)胞貼壁, 添加培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)50%-60%, 用無(wú)血清dmem 培養(yǎng)液洗2次, 再加條件培養(yǎng)液, 繼續(xù)培養(yǎng)48h, 收集蓋玻片并應(yīng)用4% 多聚甲醛固定,爬片制作成功后按照以下步驟染色: ⑴梯度乙醇水化; ⑵3ml/l h₂o₂封閉30min; ⑶20mg/l蛋白酶k消化液作用20min; ⑷tunel反應(yīng)液, 37℃孵育60min; ⑸過(guò)氧化物酶連接的抗熒光素抗體, 37℃孵育30min;注意：以上2-5步以后均以10mmol/l pbs( ph7.4)輕輕振洗3次, 每次5min; ⑹dab 顯色, 蘇木素復(fù)染, 脫水透明, 封片。以pbs 替代tunel反應(yīng)液作陰性對(duì)照, 陽(yáng)性對(duì)照爬片經(jīng)dnaseⅠ預(yù)處理10min, 再接tunel染色步驟。結(jié)果判定: 光鏡下觀察tunel染色爬片的顯色反應(yīng), 數(shù)5個(gè)以上高倍視野, 不少于1000個(gè)細(xì)胞, 重復(fù)5次。細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為tunel陽(yáng)性細(xì)胞, 即凋亡細(xì)胞。記數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并以百分?jǐn)?shù)表示, 作為細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.2.3 應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析 收集消化的貼壁細(xì)胞, pbs 沖洗后重懸在4℃、70%的乙醇中1-2h, 以1000r/min離心細(xì)胞后重懸在含100mg/l rna 酶和10mg /l碘化丙啶的pbs中,在25℃避光孵育15min。用facscalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行單色熒光細(xì)胞流式計(jì)數(shù)。結(jié)果用multiplus software軟件分析數(shù)據(jù), 每個(gè)樣本收集10000個(gè)細(xì)胞, 重復(fù)3次。

1.2.4 westernblot方法檢測(cè)空氣負(fù)離子作用前后磷酸化p38mapk 的蛋白表達(dá) 取體外培養(yǎng)的10⁷~10⁸個(gè)hepa1-6細(xì)胞在1ml ripa裂解緩沖液中勻漿提取蛋白, 測(cè)定提取的蛋白濃度。每個(gè)上樣孔加樣30μg蛋白, 經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后雜交, 一抗為山羊抗人磷酸化p38mapk單抗( santa cruz公司, 1：400), 二抗為hrp標(biāo)記兔抗山羊igg抗體( santa cruz公司, 1：4000) , ecl顯色( amersham公司) , 拍照, 密度掃描測(cè)各條帶吸光度( ia )。以ia (目的條帶/β-actin對(duì)照條帶) , 表達(dá)各標(biāo)本上述蛋白含量, 重復(fù)10次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用spss13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 計(jì)量資料用(

感谢您访问我们的网站，您可能还对以下资源感兴趣：